Nature | 切饼干模型：NINJ1打孔蛋白如何导致细胞膜破裂？

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Ninjurin (NINJ) 家族蛋白是跨膜蛋白，最初是作为粘附分子被发现的，它们可以在轴突损伤后促进其生长¹。该家族蛋白在成人和胚胎组织中广泛表达，并在组织中发挥重要作用²。哺乳动物有两个NINJ 家族成员，分别是NINJ1 和NINJ2，它们具有保守的跨膜区和55%的整体序列同源性，但与任何其他已知蛋白质没有显著的同源性。NINJ1和NINJ2预测的结构包括 N 端区域、两亲性螺旋区域和C 端的两个保守的疏水性跨膜螺旋（图 1A）。N 末端区域可介导 NINJ1 的细胞粘附和神经突延伸功能²。NINJ1的细胞粘附功能对于促进骨髓细胞迁移至炎症病变区域也非常重要³。NINJ1是p53 的靶标，在全身炎症和肿瘤发生中都表现出复杂的功能⁴。其中，NINJ1，而不是NINJ2，是细胞焦亡或其他形式的裂解性细胞死亡中GSDMD 激活导致LDH 释放所必需的⁵。该过程被认为涉及质膜上的NINJ1 寡聚化以诱导膜破裂。然而，尽管功能上证明了其重要性，但NINJ1 寡聚化和引起膜破裂的机制仍不清楚。

2024年4月25日，哈佛医学院HaoWu课题组在Cell上发表了题为“NINJ1mediates plasma membrane rupture by cutting and releasing membrane disks”的文章。该文章报道了从NINJ1环中分节出的NINJ1寡聚物的冷冻电镜结构，分辨率为4.3 Å。这项研究提出了一种叫做“切饼干”的焦亡细胞裂解机制，其中蛋白质NINJ1 的寡聚化在质膜上打孔并释放出饼干形状的质膜盘状结构（图1）。

图 1. NINJ1激活导致膜破裂的切饼干模型

首先，本文在大肠杆菌中纯化了NINJ1和NINJ2蛋白，在负染观察时发现二者都会在去垢剂（LMNG:CHS= 10:1）中形成不规则的环状和条状结构（图2C）。此外，通过脂质试纸检测发现二者都会和带负电的脂质结合，包括磷质酸（PA）和磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）。随后，作者使用带有这两种脂质的脂质体与NINJ1和NINJ2分别混合之后进行负染观察。他们意外地发现：NINJ1可以将脂质体溶解，但是NINJ2不行（图2E，F）。

图 2 NINJ1可以形成环状结构导致膜破裂

研究者们首先尝试在脂质体上重构环状结构然后尝试通过冷冻电镜解析其结构。但最后发现样品的均一性比较差导致没能拿到高分辨率的结构，其二维分类结果如图3A和3B。随后，他们尝试使用去垢剂去解析结构，因为去垢剂条件下和脂质体上的环状结构很相似。因为该环状结构是不规则的，所以本文将部分结构作为一个单元进行结构解析，包含了6-7个亚基，其二维分类结果如图3C和3D。最终重构的结构分辨率为4.3 Å（图3E）。本文通过重复排列这些单元来解释环状结构的形成以及改变相邻单元排列的角度来解释环状结构的不同大小（图3F，G）。最终搭建的模型包含了两条两亲性的螺旋（氨基酸37-70，⍺1和⍺2），二者相对于彼此形成了90度夹角。此外该模型还包含了一对跨膜螺旋：⍺3（氨基酸78-104）和⍺4（氨基酸113-140）（图3H）。N端比较无序所以没有在结构中看到，这一段对于细胞粘附比较重要，但是不在焦亡过程中起作用。NINJ1之间的相互作用通过⍺1像伸出一只手一样与相邻的亚基之间的相互作用实现（图3I）。NINJ1形成的环状结构内侧是疏水的，外侧含有⍺1和⍺2是亲水的（图3L），这种结构符合当⍺1和⍺2插入到凸面的时候，NINJ1就会形成一个“腰带”状的结构将一块细胞膜切出来。该结构和2023年发表的另一篇文章中NINJ1的结构很像，但是也有显著的不同⁶。首先，之前的结构中NINJ1会形成一个双层纤维状结构，其中每个纤维都是直的。其次，之前结构中的跨膜区也都是直的而不是发生弯曲的（图3M）。

 图 3. NINJ1环的冷冻电镜结构

接下来研究者们使用了人的单核细胞系THP-1来对NINJ1导致的细胞裂解进行观察。首先他们发现当诱导表达NINJ1之后，nigericin诱导下NLRP3炎症小体激活中ASC蛋白表达更多（图4A）。这和NLRP3激活之后膜损伤以及K⁺外流是一致的。本文还观察了NLRP激活之后NINJ1的实时变化（图4D）。发现在细胞边缘有很强烈的绿色荧光信号，认为可能是NINJ1包裹着的细胞膜，但是也没有完全证实。

图 4. THP-1细胞上的NINJ1环

本文继续低速离心了诱导表达NINJ1的THP-1细胞，发现NINJ1只会出现在Dox诱导表达的细胞中，在细胞沉淀里主要是单体。一旦加入nigericin诱导，细胞沉淀会丢掉大部分的NINJ1，而上清中会包含寡聚化的NINJ1（图5A）。之后经过高速离心发现NINJ都在膜组分中（图5B），随后通过负染观察，但是并不能确定观察到的盘状结构上确实有NINJ1（图5C）。本文还观察到了脂质和NINJ1-GFP会发生共定位（图5D）。

图 5. NINJ1形成的盘状膜在激活的THP-1细胞上清

本文根据解析的结构也设计了一系列突变去验证结构的正确性，对于所有的突变都做了相关实验，包括是否可以寡聚化、脂质体裂解、细胞死亡实验和细胞膜定位实验（图6）。此外，也针对NINJ2和NINJ1一些非保守氨基酸进行了突变去解释为什么NINJ2没有NINJ1的一系列功能。

图 6. NINJ1的突变分析

最后，本文想观察一下焦亡过程中内源的NINJ1是否会形成环状结构。他们通过STED没有观察到很大的结构，所以换用了MINFLUX（minimal photon fluxes）纳米显微镜去观察，发现内源的NINJ1形成了一些环状、点状以及其他的形状（图7D）。而且他们还发现环状结构会逐渐增多（图7F）。

图 7. MINFLUX证明NINJ1会形成不均一的环状结构

总结来说，本文通过一系列结构生物学实验和细胞实验证明了NINJ1单体可以发生寡聚化并且插入细胞膜中切下来对应的一块膜造成细胞膜破裂（图8）。但是还有很多没有解决的问题，包括NINJ1是如何被激活的以及它内源的更多的研究等等，都需要进一步的研究。

图 8. NINJ1激活和膜破裂的模型

供稿 | 田露

审核 ｜张颖

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 雨萱

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原文链接

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)00300-3

参考文献

参考文献

1. Araki, T. & Milbrandt, J. Ninjurin, a novel adhesion molecule, is induced by nerve injury and promotes axonal growth. Neuron 17, 353-361 (1996).

2. Araki, T., Zimonjic, D. B., Popescu, N. C. & Milbrandt, J. Mechanism of homophilic binding mediated by ninjurin, a novel widely expressed adhesion molecule. Journal of Biological Chemistry 272, 21373-21380 (1997).

3. Ifergan, I. et al. Role of ninjurin‐1 in the migration of myeloid cells to central nervous system inflammatory lesions. Annals of neurology 70, 751-763 (2011).

4. Yang, H. J. et al. Ninjurin 1 has two opposing functions in tumorigenesis in a p53-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences 114, 11500-11505 (2017).

5. Kayagaki, N. et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature 591, 131-136 (2021).

6. Degen, M. et al. Structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death. Nature 618, 1065-1071 (2023).

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